吉大《医学微生物学》拓展资源（二）

吉大《医学微生物学》拓展资源（二）满分答案

吉大《医学微生物学》拓展资源（二）
细菌鉴定中常见的生理生化反应实验
一、实验目的。
1)了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。
2)了解不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况。
3)了解细菌在不同培养基的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。
二、实验原理。
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。
1、糖（醇）类发酵试验
不同的细菌含有发酵不同的糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同，产生的代谢产物也不同：有的产酸产气，有的产酸不产气。指示剂溴甲酚紫，pH5.2黄色—pH6.8紫色，当发酵产酸时，培养基将由紫变黄。产气可由杜氏小管中有无气泡来证明。
2、甲基红试验（M.R试验）
甲基红试验，pH4.4红色～pH6.2黄色，是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。有些细菌分解糖类产生丙酮酸，丙酮酸进一步反应形成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到4.2以下。有些细菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将有有机酸转化为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。
3、Voges-Proskauer试验（伏-普试验，V.P. 试验）
伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。某些细菌分解葡萄糖成丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化为二乙酰，二乙酰与培养基中所含的胍基作用，生成红色化合物为V.P.反应阳性。
4、靛基质试验
某些细菌，如大肠杆菌，能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质，靛基质与对二甲基氨基苯甲酸结合，形成玫瑰色靛基质。
5、硫化氢试验
某些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应，形成黑色的硫化铁沉淀，为硫化氢试验阳性。
6、明胶液化实验
明胶在25度以下可维持凝胶状态，以固体状态存在，而在25度以上时明胶就会液化。有些微生物可产生一种成为明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4度仍能保持液化状态。
7、柠檬酸盐利用试验
有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂pH6.0(黄)～7.6(蓝)，由绿色变为深蓝色。
8、淀粉水解实验
细菌水解淀粉的过程可以通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。
三、实验仪器、材料和用具
实验仪器：32度恒温培养箱、4度冰箱；
微生物材料：大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌、待鉴定的未知菌的平板单菌落；
试剂：甲基红试剂、V.P.试剂、吲哚试剂，KOH溶液；
实验用具：
试管：每个试验3根试验管，1根对照管，8个试验，共32管；
杜氏小管、接种环、接种针、酒精灯、火柴、试管架、记号笔。
四、实验步骤。
1、配制培养基（上次实验完成）
2、鉴别实验
1）、糖(醇)类发酵试验
编号：在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号，下同。
接种：取葡萄糖发酵培养基3支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。同样取3支乳糖发酵培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。
将已接种好的培养基置32℃温箱中培养24h。
2）、甲基红试验(M.R.试验)
将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，32℃培养 24h，加甲基红指示剂数滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。
3）、伏一普试验(V．P．试验)
将被检菌接种到葡萄糖蛋白胨水中，32℃培养24h，取出，加入40％KOH 7滴，然后再加入等量的5％a-萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温30min，以加快反应速度。若培养物呈现红色，为伏—普反应阳性。
4)、靛基质(吲哚)试验
将被检菌接种到胰蛋白胨水培养基中，32℃培养24h后，滴加数滴吲哚试剂于培养物液面，轻轻摇动，观察结果。
出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。
5)、 硫化氢试验：
将大肠杆菌和变形杆菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，32℃培养24h，观察结果，若有黑色出现者为阳性。
6)、明胶液化试验
取大肠杆菌和枯草杆菌的纯培养物少许，以接种针分别穿刺接种到营养明胶培养基中，置32℃培养24小时。故观察结果时，应将明胶培养基轻轻放入4℃冰箱30min，此时明胶又凝固。若放置于冰箱30min仍不凝固者，说明明胶被试验细菌液化，是为阳性。
7）、柠檬酸盐利用试验
取少量被检菌接种到柠檬酸盐培养基上，32℃培养24h后，观察结果。培养基变深蓝色者为阳性。
8）淀粉水解试验
在培养进表面滴加碘液，观察是否变紫。
五、实验结果及分析
1、观察结果如下表：
表1   实验结果
编号 大肠杆菌 枯草杆菌 产气杆菌 变形杆菌 未知菌 空白对照
葡萄糖发酵实验 变黄色，有气泡 / / 变黄色，无气泡 变黄色，无气泡 紫色，无气泡
乳糖发酵实验 变黄色，有气泡 / / 紫色，无气泡 紫色，无气泡 紫色，无气泡
甲基红试验 红色 / 黄色 / 桔红色 淡黄色
伏-普试验 黄色  红色  红色 淡黄色
吲哚试验 玫瑰红色 / 玫瑰红色 / 无色 淡黄色
硫化氢试验 黄色 / / 黑色从中间向外蔓延 黄色 黄色
明胶液化试验 无液体 / 无液体 / 液体 无液体
柠檬酸盐利用试验 下蓝上黄 / 下黄上蓝 / 下蓝上黄 绿色
淀粉试验 紫色 紫色 紫色 黄色 紫色 紫色
表2. 各项生理生化实验现象及意义
  阳性 阴性（对照）
现象 意义 现象 意义
葡萄糖发酵实验 溶液变黄 细菌代谢产有机酸 溶液仍为紫色 细菌代谢不产酸
杜氏小管中有气体（>体积10% ） 细菌代谢产生气体 杜氏小管中无气体 细菌代谢不产生气体
乳糖发酵实验 溶液变黄
细菌代谢产有机酸 溶液仍为紫色 细菌代谢不产酸
杜氏小管中有气体（>体积10% ） 细菌代谢产生气体 杜氏小管中无气体 细菌代谢不产生气体
甲基红试验 加入甲基红，培养基呈现红色 pH下降到4.2以下 加入甲基红，培养基为黄色 pH值大于6
伏-普试验 培养基呈现红色 细菌代谢产生乙酰基甲醇 培养基为黄色 细菌代谢不产生乙酰基甲醇
吲哚试验 培养基呈现红色 细菌代谢可分解色氨酸 培养基为黄色 细菌代谢不能分解色氨酸
硫化氢试验 产生黑色固体 细菌代谢产生硫化氢 无黑色固体产生 细菌代谢不产生硫化氢
明胶液化试验 明胶在4℃仍能保持液化状态 细菌可产生明胶酶 明胶在25℃以下不能液化 细菌不能产生明胶酶
柠檬酸盐利用试验 培养基由绿色变为深蓝色 细菌可利用柠檬酸盐作为碳源 培养基仍为绿色 细菌不能利用柠檬酸盐作为碳源
淀粉水解试验 不变，黄色 细菌可利用淀粉 变紫 细胞无法利用淀粉
2.照片及分析：
1）、糖(醇)类发酵试验

图1  葡萄糖发酵（从左到右依次为对照、大肠杆菌、未知菌、变形杆菌）
 
图2  乳糖发酵（从左到右依次为对照、未知菌、变形杆菌、大肠杆菌）
2）、 甲基红试验(M.R.试验)
 
图3 甲基红试验（从左到右依次为对照、大肠杆菌、产气杆菌、未知菌）
3）、 伏一普试验(V．P．试验)
 
图4 V.P试验（从左到右依次是大肠杆菌、产气杆菌、未知菌）
4)、靛基质(吲哚)试验

图5  吲哚试验（从左到右依次是对照、未知菌、产气杆菌、大肠杆菌）
5)、硫化氢试验：

图6 硫化氢试验（从左到右依次是对照、未知菌、变形杆菌、大肠杆菌）
6)、明胶液化试验
 
图7  明胶液化试验（从左到右依次是对照、未知菌、大肠杆菌、枯草杆菌）
7)、柠檬酸盐利用试验

图8  柠檬酸盐利用实验（从左到右依次是对照、未知菌、产气杆菌、大肠杆菌）
8)、淀粉水解试验
 
现象：淀粉水解实验中，除了未知菌外，所有菌均有变蓝的现象。
分析：未知菌分解了淀粉，其他菌无法分解或只能少量利用淀粉。
六、实验小结
这次实验重点是观察，而且要注意观察前的操作，比如明胶要观察必须先在4℃冰箱冷藏，拿出来后要尽快观察防止其在室温下融化；而吲哚试验要注意不要晃动，因为产生的玫瑰色靛基质本来就不多，如果剧烈晃动使之扩散开来的话，就基本上看不见了；V.P.试验是最纠结的，很多组在32℃下放了很久还是没有现象，我们开始认为是因为温度不够，可是加热也没有效果，于是考虑是不是试剂的问题，于是擅自用了实验室边台用于调pH的NaOH溶液，结果果然变红了。
七、思考
1、接种后的明胶试管可以在37度培养，在培养后你必须采取什么措施才能证明液化的存在？
将明胶培养基放入4℃冰箱30min，仍不凝固说明明胶被试验细菌液化，为阳性。
2、在吲哚试验和硫化氢产生试验中细菌各分解哪种氨基酸？
吲哚试验：含有色氨酸酶的细菌（如大肠杆菌、变形杆菌等）可分解色氨酸生成吲哚。
硫化氢试验：变形杆菌、乙型副伤寒杆菌等能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氢。
3、假设某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现怎样的结果？
不产酸，产气。有机酸将被转化为非酸性末端产物，培养基呈黄色。葡萄糖发酵实验中，培养基颜色由紫变黄，杜氏小管中气体超过10%。
4、通过哪些生理生化反应可以区分大肠杆菌和变形杆菌？
可以通过葡萄糖发酵实验、乳糖发酵实验、硫化氢实验来区分两者，大肠杆菌和变形杆菌都可以得到葡萄糖发酵实验的阳性反应，而只有大肠杆菌可以得到乳糖发酵实验的阳性反应，硫化氢实验中，变形杆菌能使培养基变成黑色。
八、参考文献
陈金春  微生物实验教程 清华大学出版社 2005年

吉大《医学微生物学》拓展资源（二）历年参考题目如下：